研究背景

卵泡刺激素（FSH）是驅動卵泡發育的關鍵內分泌信號，雖已知其能促進顆粒細胞（GCs）的糖酵解和乳酸生成，但糖酵解通量如何與線粒體生物發生相偶聯的機制尚不清楚。近年來，乳酸被重新認識為一種生物活性代謝物，可通過組蛋白乳酸化修飾將細胞代謝狀態與染色質結構和基因調控聯系起來。然而，這種代謝-表觀遺傳調控機制是否在FSH介導的卵泡發育生理過程中發揮作用，特別是如何協調線粒體生物發生以滿足卵泡生長的能量需求，仍是未解之謎。

研究結果

2.1 FSH誘導的線粒體生物發生伴隨卵巢顆粒細胞中H4K5la升高

研究人員通過腹腔注射FSH評估其對小鼠卵巢顆粒細胞（mGCs）線粒體生物發生的影響。結果顯示，FSH刺激增加了mGCs中線粒體DNA編碼的細胞色素c氧化酶II（MT-CO2）基因和mtDNA D-loop區域的拷貝數，線粒體標志物TOM20水平升高。透射電鏡進一步顯示FSH顯著增加mGCs中線粒體數量，同時保持超微結構完整性，包括膜形態和嵴組織，線粒體體積也增加，提示FSH暴露后線粒體融合增強。FSH處理還顯著上調線粒體融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1表達，而裂變蛋白DRP1及其Ser616磷酸化水平降低，Ser637磷酸化增加，表明線粒體裂變受抑制。FSH處理還顯著提高了mGCs中ATP水平。由于FSH在卵泡發育過程中增加糖酵解導致乳酸升高，研究人員評估了乳酸是否促進FSH介導的線粒體生物發生。FSH注射后，mGCs表現出顯著增加的葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）表達和乳酸水平。免疫組織化學顯示FSH處理后卵巢組織中乳酸化顯著增加，主要定位于mGCs。質譜分析鑒定出組蛋白H4第5位賴氨酸（H4K5）的乳酸化，免疫組織化學染色顯示H4K5la在顆粒細胞中特異性富集，而卵母細胞和膜細胞信號極弱。這些發現表明乳酸衍生的H4K5la可能作為FSH誘導的mGCs線粒體生物發生的表觀遺傳介質。

2.2 抑制乳酸產生/H4K5la抑制FSH誘導的顆粒細胞線粒體生物發生

為確定FSH是否通過乳酸/組蛋白乳酸化途徑促進線粒體生物發生，研究人員在KGN細胞中測量了FSH處理后的細胞外酸化率（ECAR）。FSH顯著增加ECAR，表明糖酵解活性增強。為調節細胞內組蛋白乳酸化，研究人員采用兩種互補方法：（a）使用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）和草氨酸鹽藥理學抑制糖酵解通量以抑制乳酸產生；（b）siRNA介導的乳酸脫氫酶A（LDHA）和LDHB敲低。兩種抑制劑處理均有效降低mGCs中細胞內乳酸水平，并顯著降低FSH刺激的mGCs和KGN細胞中的全局蛋白乳酸化和H4K5la水平。免疫熒光顯示2-DG和草氨酸鹽有效抑制FSH刺激的KGN細胞中H4K5la。組蛋白乳酸化降低顯著損害了FSH誘導的顆粒細胞線粒體生物發生，表現為線粒體DNA拷貝數、TOM20蛋白豐度和MitoTracker Green熒光減少。考慮到2-DG和草氨酸鹽的潛在脫靶效應，研究人員通過遺傳耗竭LDHA/B來特異性調節乳酸依賴性組蛋白乳酸化。雙重LDHA/B沉默顯著降低細胞內乳酸生成、全局蛋白乳酸化和H4K5la。免疫熒光分析證實LDHA/B敲低后FSH刺激的H4K5la受損。相應干預抑制了FSH誘導的線粒體生物發生，表現為線粒體DNA拷貝數減少、TOM20表達降低和MitoTracker Green染色減弱。為評估乳酸補充是否能挽救這一表型，研究人員用乳酸鈉處理LDHA/B耗竭的KGN細胞。外源性乳酸顯著恢復了FSH刺激細胞中的H4K5la和線粒體生物發生。此外，FSH處理顯著增強KGN細胞的氧消耗率（OCR），而抑制乳酸產生減弱了這一效應，乳酸補充wan全挽救了OCR。類似地，LDHA/B敲低降低了FSH刺激的ATP產生，乳酸鈉可恢復。使用JC-1熒光探針實時監測線粒體膜電位（ΔΨm）發現，FSH處理顯著增加紅色熒光（J-聚集體，表示超極化）同時降低綠色熒光（JC-1單體，表示去極化）。重要的是，藥理學抑制乳酸產生顯著減弱FSH誘導的ΔΨm升高，而乳酸鈉補充wan全挽救了這一超極化效應。為確定FSH是否通過抑制線粒體自噬增強線粒體含量，研究人員評估了線粒體自噬標志物。在FSH處理的KGN細胞中，PINK1/Parkin和LC3-II表達增加，而p62表達降低，與激活的線粒體自噬通量一致。FSH處理后線粒體-溶酶體共定位也增加。這些結果共同表明FSH通過乳酸/組蛋白乳酸化途徑而非抑制線粒體自噬促進顆粒細胞線粒體生物發生。

2.3 FSH通過P300/CBP催化的H4K5la促進線粒體生物發生

為鑒定負責H4K5la的酶，研究人員使用siRNA方法在KGN細胞中沉默候選酰基轉移酶。P300及其同源物CBP的敲低降低了H4K5la，鑒定P300/CBP為與該乳酸化特征相關的關鍵乳酸轉移酶。研究人員接下來使用C646（特異性P300/CBP拮抗劑）抑制該復合物。如預期，C646處理有效抑制FSH處理的mGCs和KGN細胞中的全局乳酸化和H4K5la。由于P300/CBP也可通過作為寫入蛋白催化乙酰化，研究人員評估了FSH處理的KGN細胞中的乙酰化水平。然而未觀察到顯著變化，且C646未消除全局乙酰化，表明P300/CBP不是wei一的乙酰轉移酶或其作用在這些細胞中被補償。接下來研究人員檢查了P300/CBP抑制后的線粒體生物發生。P300/CBP抑制消除了FSH誘導的線粒體DNA含量增加和TOM20表達。MitoTracker染色證實C646阻斷FSH刺激的線粒體生物發生。與此一致，C646顯著減弱FSH刺激的OCR和線粒體膜電位。為解決C646可能產生超出乳酸化抑制的脫靶效應的擔憂，研究人員進行了P300和CBP的單獨沉默。類似地，酶缺失顯著降低全局和H4K5乳酸化，并相應減少KGN細胞中FSH誘導的線粒體生物發生，表現為線粒體DNA拷貝數、TOM20表達和MitoTracker Green熒光降低。P300/CBP敲低還抑制FSH誘導的線粒體膜電位升高。這些數據共同證明P300/CBP介導的H4K5la促進FSH驅動的顆粒細胞線粒體生物發生。

2.4 鑒定H4K5la調控的下游靶基因

為評估組蛋白乳酸化對FSH激活顆粒細胞中基因表達的影響，研究人員使用H4K5la特異性抗體進行CUT&Tag分析。質量控制分析證實樣本間高相關性和適當的DNA片段大小分布。H4K5la峰主要富集于啟動子區域。GO分析顯示H4K5la靶基因在mGCs中強烈富集于代謝調控，而KEGG通路注釋同樣顯示在代謝網絡中富集，表明組蛋白乳酸化有助于線粒體生物發生的基礎代謝基因表達調控。為檢查功能后果，研究人員對LDHA/LDHB敲低后的FSH處理mGCs進行RNA測序。差異表達分析顯示與FSH處理對照相比，FSH + LDHA/B-si組中有1,773個下調基因和1,335個上調基因。下調基因的KEGG富集指向核心代謝過程，表明乳酸依賴性乳酸化支持線粒體生物發生的基礎代謝基因表達。通過整合CUT&Tag數據（下調的H4K5la峰）與FSH處理GCs ± LDHA/B敲低的RNA-seq數據（下調基因），研究人員鑒定出71個H4K5la靶基因，其轉錄在LDHA/B耗竭后顯著降低。為進一步將FSH誘導的H4K5la與線粒體生物發生聯系起來，研究人員分析了FSH處理mGCs的RNA-seq譜，鑒定出2,003個下調和1,718個上調基因。KEGG分析顯示上調轉錄本與線粒體生物發生通路密切相關。將這些基因與71個差異表達基因交叉參考，鑒定出22個被FSH顯著誘導且在LDHA/LDHB敲低后顯著下調的H4K5la靶基因。在這些基因中，HDAC4（一種作為乙酰化而非乳酸化擦除器的HDAC II類去乙酰化酶）在其啟動子處顯示強烈的H4K5la富集。與此發現一致，qRT-PCR證實FSH刺激的mGCs和KGN細胞中草氨酸鹽處理或LDHA/LDHB敲低后HDAC4 mRNA表達降低。ChIP-qPCR進一步驗證了FSH刺激下HDAC4啟動子處的H4K5la富集，該富集被草氨酸鹽、LDHA/B沉默或使用C646抑制乳酸化寫入蛋白P300所減弱。免疫印跡顯示草氨酸鹽、LDHA/LDHB敲低或C646處理后HDAC4蛋白降低。免疫熒光染色證實抑制乳酸產生和H4K5la降低HDAC4蛋白表達，HDAC4主要定位于細胞核。這些結果共同確立FSH誘導的H4K5la驅動顆粒細胞中HDAC4的轉錄上調。

2.5 HDAC4促進FSH誘導的線粒體生物發生

在確立H4K5la調控HDAC4表達后，研究人員接下來研究了HDAC4在FSH處理顆粒細胞中的功能作用。使用LMK-235（特異性IIa類去乙酰化酶家族拮抗劑，據報道可在轉錄和翻譯水平抑制HDAC4表達）處理顆粒細胞。如預期，LMK-235處理后KGN細胞中HDAC4表達以濃度依賴性方式降低。基于這些結果，選擇15 μM LMK-235作為后續實驗的標準濃度。通過qRT-PCR定量線粒體DNA含量、線粒體標志物TOM20免疫印跡和MitoTracker Green染色線粒體證明，HDAC4的藥理學抑制顯著減弱FSH誘導的mGCs和KGN細胞線粒體生物發生。為最小化LMK-235與HDAC4抑制無關的潛在脫靶效應，研究人員隨后采用siRNA介導的方法特異性沉默HDAC4。初步評估了四種靶向HDAC4的siRNA的基因沉默效率和特異性。FSH刺激下HDAC4敲低顯著損害線粒體生物發生，表現為線粒體DNA拷貝數減少、TOM20蛋白水平降低和MitoTracker Green熒光減弱。與此一致，HDAC4耗竭抑制KGN細胞中FSH誘導的OCR和ΔΨm增加。這些結果牢固確立HDAC4作為顆粒細胞響應FSH的線粒體生物發生關鍵調節因子。

2.6 HDAC4通過位點特異性去乙酰化調節PGC-1α活性以促進線粒體生物發生

PGC-1α是代謝途徑的既定主調節因子。先前研究表明HDAC4直接靶向PGC-1α并在賴氨酸殘基K329和K330去乙酰化以調節其活性，但這些位點的乙酰化是否影響線粒體生物發生仍未知。為解決這個問題，研究人員檢查了HDAC4介導的PGC-1α賴氨酸去乙酰化在線粒體調節中的作用。跨物種序列比對顯示PGC-1α K329/K330的強烈進化保守性，突出其潛在功能重要性。研究人員首先評估了FSH刺激的KGN細胞中PGC-1α乙酰化，觀察到FSH處理后乙酰化顯著降低，P300/CBP抑制劑C646逆轉了這一效應。類似地，HDAC4敲低增加了FSH處理細胞中PGC-1α乙酰化。接下來研究人員將K329/330殘基單獨突變為不可乙酰化的精氨酸（R）殘基或可乙酰化的谷氨酰胺（Q）殘基，并檢查每個突變體暴露于FSH時的乙酰化水平。KGN細胞通過脂質體轉染表達野生型（WT）Flag-PGC-1α或其乙酰化模擬（K329/330Q）和不可乙酰化（K329/330R）變體。為確保檢測直接乙酰化，免疫沉淀復合物用SDS解離后用泛乙酰賴氨酸抗體免疫印跡。K329/330R突變幾乎消除了FSH誘導的PGC-1α乙酰化，證實這些位點代表主要乙酰化位點。為全面繪制與PGC-1α相關的乙酰轉移酶，研究人員在NIH/3T3細胞中進行IP后質譜分析。這種方法定義了PGC-1α相互作用組并鑒定出1,472個推定相互作用蛋白，包括其乙酰化的潛在介質。GO富集分析突出顯示這些相互作用因子與線粒體生物發生通路的強烈關聯。基于功能注釋優先篩選出11個候選乙酰轉移酶。靶向siRNA篩選鑒定DLAT和ACAT1為PGC-1α翻譯后修飾的關鍵調節因子，其耗竭顯著降低PGC-1α乙酰化。后續co-IP實驗證實兩種酶與PGC-1α相互作用，這些相互作用被FSH刺激動態破壞。研究人員隨后評估PGC-1α乙酰化是否影響FSH誘導的線粒體生物發生。KGN細胞在siRNA介導的內源性PGC-1α耗竭后轉染WT PGC-1α或K329/330R和K329/330Q突變體。K329/330R突變體（去乙酰化模擬）顯著增強線粒體生物發生，而乙酰化模擬K329/330Q突變體損害線粒體生物發生，表現為（a）線粒體DNA拷貝數減少，（b）TOM20水平降低，和（c）MitoTracker Green染色減少。相應地，K329/330R突變體升高線粒體OCR、ATP水平和ΔΨm，而K329/330Q突變體產生相反效應。這些發現共同證明FSH通過HDAC4介導的PGC-1α K329/330去乙酰化促進線粒體生物發生。

2.7 PGC-1α去乙酰化招募NRF1/2以驅動線粒體生物發生

PGC-1α作為線粒體生物發生的主調節因子，協同轉錄因子如NRF1和GABPA（NRF2）激活線粒體功能所需的核基因。為確定K329/330乙酰化如何影響PGC-1α活性，研究人員通過co-IP檢查FSH依賴性變化。FSH刺激顯著增強PGC-1α與NRF1/NRF2的相互作用，而破壞乳酸依賴性H4K5la消除這一效應。類似地，暴露于P300/CBP抑制劑C646或HDAC4耗竭顯著減弱KGN細胞中FSH誘導的PGC-1α-NRF1/2復合物形成。為評估K329/330乙酰化的功能意義，研究人員在KGN細胞中表達Flag標記的PGC-1α變體（WT、乙酰化缺陷K329/330R或乙酰化模擬K329/330Q）。K329/330R突變增強FSH刺激下PGC-1α與NRF1/NRF2的結合，而K329/330Q變體顯著損害這些相互作用。與此一致，ChIP-qPCR顯示FSH處理細胞中K329/330R突變體對NRF1/NRF2靶基因（TFAM、TFB1M、TFB2M）啟動子的占據增加，而K329/330Q突變體染色質結合顯著降低。這些結果共同表明PGC-1α在K329/330的去乙酰化促進其招募至NRF1/2并驅動響應FSH的線粒體基因程序激活。PGC-1α必須從細胞質轉位至細胞核以發揮轉錄輔激活因子功能。為確定乙酰化是否調節其亞細胞分布，研究人員用Flag標記的WT PGC-1α轉染KGN細胞并進行核-胞質分級分離。FSH處理誘導PGC-1α強烈的核定位，而LMK-235抑制HDAC4或HDAC4特異性siRNA減弱這一核積累。為進一步探究K329/330乙酰化的作用，研究人員表達WT、K329/330R或K329/330Q PGC-1α構建體后進行亞細胞分級分離。K329/330R突變體增強FSH刺激的PGC-1α核進入，而K329/330Q突變體減弱核定位。免疫熒光染色證實這些結果，顯示FSH處理細胞中K329/330R變體的胞質-核轉位增加和K329/330Q突變體的核-胞質重新分布增強。這些發現表明FSH降低PGC-1α乙酰化，促進其核進入并增強線粒體生物發生。

2.8 抑制H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路損害體內FSH誘導的線粒體生物發生和卵泡發育

為評估H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路的生理相關性，接受FSH的小鼠用靶向該軸關鍵組分的抑制劑處理：C646（P300/CBP乳酸化抑制劑）、LMK-235（HDAC4拮抗劑）或SR-18292（PGC-1α乙酰化激活劑）。C646處理消除了卵巢顆粒細胞中FSH誘導的H4K5la，并伴隨抑制HDAC4表達。與HDAC4介導的PGC-1α去乙酰化一致，通路阻斷增加PGC-1α乙酰化并破壞PGC-1α-NRF1/NRF2相互作用。重要的是，該通路阻斷顯著損害FSH誘導的線粒體生物發生，表現為線粒體基因表達降低、mtDNA拷貝數減少和TOM20蛋白水平降低。線粒體缺陷伴隨雌二醇（E2）產生減少和顆粒細胞增殖降低。在器官水平，抑制劑處理的小鼠表現出卵巢變小、卵巢重量降低、卵泡發育停滯和竇卵泡形成減少。這些發現共同證明H4K5la/HDAC4/PGC-1α軸對FSH介導的卵泡發育至關重要，通過支持線粒體代謝適應。

n 研究結論

本研究揭示了一個先前未表征的FSH依賴性代謝-表觀遺傳通路，將糖酵解與線粒體生物發生聯系起來。FSH刺激的糖酵解增加細胞內乳酸，通過P300/CBP介導的H4K5組蛋白乳酸化（H4K5la），該修飾富集于代謝基因啟動子并直接激活HDAC4轉錄。HDAC4介導的PGC-1α在K329/K330去乙酰化促進NRF1/2招募和線粒體DNA復制及線粒體生物發生必需基因的轉錄。該機制可能代表代謝通量控制細胞器生物發生表觀遺傳調控的更廣泛原理，為理解FSH依賴性生殖生理提供了機制見解，并突出了生殖障礙代謝功能障礙的潛在治療機會。

Wu G, Chen M, Li C, Wei M, Pan Y, He T, Liu Z, Li H, Zhang C, Zhang JQ, Sheng Y, Liu Y, Liu H, Shen M. Histone Lactylation Couples FSH-Driven Lactate Metabolism to Mitochondrial Biogenesis by Enhancing HDAC4-Mediated Deacetylation of PGC-1α in Granulosa Cells. Research (Wash D C). 2026 Jan 15;9:1045. doi: 10.34133/research.1045. PMID: 41551912; PMCID: PMC12804605.